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北京六一電腦三恒多用電泳儀電源DYY-6D在核酸與蛋白分離中的應用研究
上海儀器網 / 2025-12-02

 

一、方案詳情

1.1 方案目標

1. 基于北京六一電腦三恒多用電泳儀電源DYY-6D（以下簡稱DYY-6D）的恒壓、恒流、恒功率“三恒”特性，建立針對基因組DNA、質粒DNA及常規蛋白的標準化電泳分離流程，明確不同樣本類型下的最優電源參數設置、凝膠制備及電泳操作關鍵技術要求；2. 系統分析電壓（50-200V）、電流（10-100mA）、電泳時間（20-90min）對核酸片段分辨率、蛋白條帶清晰度及遷移速率的影響規律，確定復雜樣本（如組織基因組DNA、細胞總蛋白）的適配電泳條件；3. 以標準核酸Marker（DL2000、λ-Hind III）和蛋白Marker（10-180kDa）為參照，驗證DYY-6D在不同分離場景下的穩定性、重復性及分離準確性；4. 對比DYY-6D與普通電泳儀電源的性能差異，解決傳統設備電壓波動導致的條帶彌散、分離效率低等問題，為分子生物學實驗室提供高效可靠的電泳分離技術支撐。

1.2 實驗原理

DYY-6D作為電腦三恒多用電泳儀電源，核心功能是為電泳系統提供穩定可控的電場環境，其“三恒”控制模式可根據實驗需求精準維持電泳過程中的電壓、電流或功率恒定。在電場作用下，核酸（帶負電）與蛋白（經SDS處理后帶負電）會沿電場方向向正極遷移，遷移速率取決于分子大小、電荷密度及凝膠孔徑。
DYY-6D的技術優勢體現在三方面：一是輸出精度高，恒壓模式下電壓波動≤±0.5%，恒流模式電流波動≤±1%，可避免電場不穩定導致的條帶偏移；二是適配性廣，支持1-4組電泳槽同時工作，兼容瓊脂糖凝膠電泳（核酸）與聚丙烯酰胺凝膠電泳（蛋白）；三是智能保護完善，具備過流、過壓、過載及漏電保護功能，且實時顯示電泳參數，便于實驗過程監控。

1.3 實驗儀器與試劑

1.3.1 儀器設備

  • 核心設備：北京六一電腦三恒多用電泳儀電源DYY-6D（輸出范圍：電壓10-300V，電流4-100mA，功率1-300W，具備恒壓/恒流/恒功率切換功能，支持定時設置0-999min）；
  • 聯用設備：北京六一水平電泳槽DYCP-31BN（用于核酸電泳，凝膠面積120×100mm）、垂直電泳槽DYCZ-24DN（用于蛋白電泳，凝膠尺寸83×73mm）；
  • 輔助設備：紫外凝膠成像系統（Bio-Rad ChemiDoc XRS+）、高速冷凍離心機（Eppendorf 5418R）、移液器（10μL/100μL/1000μL，Thermo）、電子天平（梅特勒ME204E，精度0.1mg）、恒溫水浴鍋（上海一恒HH-S4）；
  • 樣品處理設備：超聲波細胞破碎儀（寧波新芝JY92-IIN）、核酸提取儀（天根DP304）。

1.3.2 試劑與材料

  • 核酸實驗試劑：瓊脂糖（西班牙Biowest）、TAE電泳緩沖液（50×濃縮液，Solarbio）、核酸Marker（DL2000：100-2000bp；λ-Hind III：500-23130bp，Takara）、GoldView核酸染料（Solarbio）、質粒DNA（pET-28a，實驗室保存）、小鼠肝臟基因組DNA（自行提?。?；
  • 蛋白實驗試劑：丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、Tris堿、甘氨酸、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R-250（均為Amresco）、蛋白Marker（10-180kDa，Thermo）、牛血清白蛋白（BSA，Sigma）、HeLa細胞總蛋白（自行提取）；
  • 其他材料：電泳級甲醇、冰乙酸（國藥集團）、一次性手套、移液器吸頭、離心管（1.5mL/50mL）、硝酸纖維素膜（GE）。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品制備

  1. 核酸樣品：①質粒DNA：通過堿裂解法提取后，用超純水稀釋至50ng/μL，-20℃保存；②基因組DNA：采用酚-氯仿法從小鼠肝臟組織中提取，經Nanodrop檢測純度（A260/A280=1.82），濃度調整為100ng/μL；③標準核酸Marker：DL2000用1×TAE緩沖液稀釋至10ng/μL，λ-Hind III稀釋至20ng/μL。
  2. 蛋白樣品：①BSA標準品：用蛋白上樣緩沖液配制濃度為0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的梯度樣品；②HeLa細胞總蛋白：通過RIPA裂解液提取，BCA法測定蛋白濃度為1.2mg/mL，加入上樣緩沖液后95℃變性5min，-80℃保存；③蛋白Marker：直接加入上樣緩沖液，無需稀釋。

1.4.2 凝膠制備

  • 核酸電泳凝膠：根據分離需求制備不同濃度瓊脂糖凝膠，①小片段核酸（100-2000bp）：1.5%瓊脂糖凝膠，加入GoldView染料（終濃度1×）；②大片段基因組DNA（500-23130bp）：0.8%瓊脂糖凝膠，染料添加同前，凝膠凝固后備用。
  • 蛋白電泳凝膠：制備SDS-PAGE凝膠，①分離膠（12%）：Acr/Bis（30%）4mL、Tris-HCl（1.5M，pH8.8）2.5mL、10%SDS 0.1mL、10%過硫酸銨0.1mL、TEMED 0.004mL，加超純水補至10mL；②濃縮膠（5%）：Acr/Bis（30%）0.67mL、Tris-HCl（0.5M，pH6.8）1.25mL、10%SDS 0.05mL、10%過硫酸銨0.05mL、TEMED 0.005mL，加超純水補至5mL。

1.4.3 電泳參數優化實驗設計

以條帶分辨率（核酸片段分離清晰度、蛋白條帶規整度）和遷移效率（單位時間內遷移距離）為核心評價指標，設計三因素三水平正交實驗（L9(3?)），優化DYY-6D的工作參數，因素及水平設置如下：
  • 核酸電泳（以1.5%瓊脂糖凝膠分離DL2000為例）：A因素（電壓）：A1（80V）、A2（120V）、A3（160V）；B因素（電流）：B1（30mA）、B2（50mA）、B3（70mA）；C因素（電泳時間）：C1（30min）、C2（45min）、C3（60min）。
  • 蛋白電泳（以12%SDS-PAGE分離HeLa蛋白為例）：A因素（電壓-濃縮膠）：A1（60V）、A2（80V）、A3（100V）；B因素（電壓-分離膠）：B1（100V）、B2（120V）、B3（150V）；C因素（電泳時間）：C1（60min）、C2（80min）、C3（100min）。
每種實驗組合重復3次，通過凝膠成像系統分析條帶灰度值與遷移距離，計算相對標準偏差（RSD），確定最優參數組合。

1.4.4 電泳操作流程

  1. 儀器連接：將DYY-6D電源與對應電泳槽連接，確保正負極對應正確（核酸/蛋白電泳均為樣品孔靠近負極），開啟電源，進入參數設置界面。
  2. 參數設置：根據樣品類型選擇“恒壓”模式（優先推薦，確保分離穩定），輸入優化后的電壓、電流上限及電泳時間參數，啟動電泳。
  3. 樣品上樣與檢測：①核酸電泳：每孔上樣量10μL（含樣品5μL+上樣緩沖液5μL），電泳結束后置于紫外凝膠成像系統下觀察并拍照；②蛋白電泳：每孔上樣量20μL，電泳結束后進行考馬斯亮藍染色2h，脫色液脫色至條帶清晰，再進行成像分析。
  4. 性能驗證：在最優參數下，對同一樣品進行6次平行電泳驗證重復性；連續5天進行標準Marker電泳，驗證電源長期穩定性；通過條帶遷移距離與Marker對比，計算核酸片段大小及蛋白分子量。

1.4.5 評價指標計算方法

  • 分辨率（R）：核酸電泳中R=2×(d2-d1)/(W1+W2)，其中d為條帶中心到上樣孔的距離，W為條帶寬度；蛋白電泳中R計算方法相同，反映條帶分離清晰度。
  • 相對標準偏差（RSD）：用于評價重復性，RSD=（標準偏差/測量值平均值）×100%，測量值包括條帶遷移距離、灰度值。
  • 遷移速率（V）：V=遷移距離/電泳時間，單位為mm/min，反映分離效率。
  • 分子量偏差率（RE）：蛋白實驗中，RE=|計算分子量-標準分子量|/標準分子量×100%，評價分子量測定準確性。

1.5 實驗結果與數據分析

1.5.1 最優電泳參數確定

正交實驗極差分析結果顯示，電壓是影響分離效果的最顯著因素（P＜0.01），電泳時間次之（P＜0.05），電流對分離效果影響較?。≒＞0.05）。不同樣本類型的最優參數及核心指標如下表所示：
樣本類型
最優參數組合
分辨率（R）
遷移速率（mm/min）
RSD（%）
DL2000核酸Marker
恒壓120V，電流50mA，45min
1.82
0.85
1.3
小鼠肝臟基因組DNA
恒壓80V，電流30mA，60min
1.56
0.42
1.1
HeLa細胞總蛋白
濃縮膠80V，分離膠120V，80min
1.95
0.38
1.5
BSA標準品
濃縮膠80V，分離膠120V，70min
2.03
0.40
1.2
以DL2000核酸Marker分離為例，部分正交實驗數據如下表所示：
實驗號
電壓（V）
電流（mA）
時間（min）
分辨率（R）
RSD（%）
3
80（A1）
70（B3）
45（C2）
1.45
2.1
5
120（A2）
50（B2）
45（C2）
1.82
1.3
7
160（A3）
50（B2）
30（C1）
1.63
1.8

 

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